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Magnetische Nanopartikel für den nicht-viralen Gentransfer

Magnetisch kontrollierter Gentransfer eröffnet prinzipiell die Möglichkeit einer gezielten Lokaltherapie bei systemischer Applikation. Am RTC haben wir eine sichere und effiziente Transfektionsmethode entwickelt und in standardisierter Form etabliert, bei der Komplexe aus non-viralen Vektoren und niedermolekularem Polyethylenimin (PEI) eingesetzt werden, welche an magnetische Nanopartikel (MNP) gekoppelt sind, um ein „Targeting“ zum Ziel über ein Magnetfeld zu erreichen. Auf diese Weise konnte sowohl in verschiedenen Zelllinien als auch in Primärzellen eine verbesserte Transfektionseffizienz bei geringer Zytotoxizität erzielt werden.
Es zeigte sich, dass der beschriebene Komplex in Kombination mit MNP bereits ohne Anlegen eines magnetischen Feldes eine höhere Transfektionseffizienz in MSCs aufwies. Mittels konfokaler Mikroskopie konnten wir nachweisen, dass pDNA in der perinuklearen Zone durch MNP in erhöhtem Maße freigesetzt wird und in den Zellkern eintritt. Die höhere Transfektionseffizienz des pDNA/PEI-Komplexes blieb bis zu 48 Stunden nach Transfektion erhalten.
Mit dieser Technik wollen wir Stammzellen zukünftig genetisch so verändern, dass sich deren therapeutische Wirksamkeit verbessert.
 
 
 

miRNAs in der Stammzelldifferenzierung

Bei der Stammzelldifferenzierung spielen microRNAs (miRNAs) als zentrale post-transkriptionale Modulatoren zur Regulierung der Genexpression eine wesentliche Rolle. Es zeigte sich ein Zusammenhang zwischen den funktionalen Veränderungen der Stammzellen in der Zellkultur unter hypoxischen Bedingungen und den signifikanten Veränderungen der globalen Genexpressionsprofile. Um die Rolle von miRNAs bei der Differenzierung zu bestimmen, wurde zunächst die Aktivität ausgewählter miRNAs in Stammzellen gezielt verändert und dann der dadurch hervorgerufene Effekt analysiert. Für miRNA-126  ist eine die Angiogenese fördernde Wirkung bekannt. Mittels in vitro Angiogenese-Tests konnten wir belegen, dass die Überexpression von miRNA-126 die Netzwerk-Bildung verstärkte, was eine erhöhte Gefäßbildung widerspiegelt. Um das hohe Potential von antisense-RNAs zukünftig therapeutisch nutzen zu können, arbeiten wir daran, unsere nichtviralen Nukleinsäure-Transfer-Techniken auf das Einbringen von miRNA in Stammzellen zu erweitern.
 
 

Zellbesiedlungstechniken für das kardiale „Tissue engineering“

Zur Verbesserung der Rekonstruktion natürlicher Gewebestrukturen werden am RTC Methoden des kardialen „Tissue Engineering“ bei der Besiedlung von Herzklappen oder der Entwicklung von „Cardiac Patches“ eingesetzt. Dabei finden zwei verschiedene Methoden zur Besiedlung von Materialien Anwendung. Mit einem Druckverfahren durch Laser-induzierten Vorwärtstransfer (LIFT) können Zellen und Biomaterialien in komplexen dreidimensionalen (3D) Matrices angeordnet werden, um so die biologische Struktur eines Gewebes möglichst genau nachzubilden. Angewandt werden kann diese Methode u.a. bei der Regeneration von infarziertem Gewebe mittels eines „Cardiac Patches“. Um die Blutgefäßbildung zu beschleunigen haben wir mittels LIFT-Verfahrens humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVEC) und mesenchymale Stammzellen (MSC) in präziser kapillarnetzähnlicher Gitterstruktur auf einen „Cardiac Patch“ aufgebracht. Durch die gezielt angeordnete Co-Kultur wurde die Gefäßbildung beschleunigt und es zeigte sich nach Aufbringen eines solchen „Cardiac Patch“ auf die Infarktzone im Rattenmodell eine Verbesserung der Herzfunktion. Das zweite am RTC eingesetzte Verfahren ist die neuartige „Drei-Kanal-Airbrush-Technik“. Mit diesem Sprühsystem haben wir geprüft, ob ein intraoperatives Herzklappen-Tissue-Engineering unter Nutzung eines Stammzell-plus-Fibrin Komposites möglich ist. Dafür haben wir einen Komplex aus humanen CD133+-Stammzellen und Fibrin auf Pulmonalklappen von Schweinen aufgesprüht. Im Bioreaktor überlebten die Zellen über 96 Stunden und es bildeten sich auf der Innenseite des Transplantats adhärente, spindelförmige CD31+- und VEGFR2+-Zellen. Dies deutet auf eine Ausdifferenzierung der CD133+ Stammzellen im Komplex unter Flußbedingungen hin. „Tissue Engineering“  bietet somit Möglichkeiten zur Verbesserung der Rekonstruktion natürlicher Gewebestrukturen im kardialen Bereich. Beide geprüften Techniken sind grundsätzlich für den kardialen Einsatz geeignet. Wir arbeiten weiter an der technologischen Optimierung der Verfahren, um das am besten geeignete Verfahren bis zur Anwendung am Menschen weiterzuentwickeln.
 
 

Erythropoetin als regenerativer Wirkstoff im Herzen

Erythropoeitin (EPO) besitzt zytoprotektive und regenerative Eigenschaften. Im Rattenmodell  konnten wir nach einmaliger intramyokardialer EPO Injektion nach Myokardinfarkt (MI) eine Reduzierung der Infarktgröße, die Inhibition des Remodeling-Prozesses, eine protektive Wirkung auf Kardiomyozyten und eine verbesserte Herzfunktion feststellen. Darüber hinaus wurden eine Erhöhung der intrakardialen Zellproliferation, eine signifikante Hochregulierung des Stammzell-Homing- Faktors SDF-1 und eine verbesserte Rekrutierung von c-Kit+ und CD34+ Stammzellen gefunden. Im ischämisch geschädigten Myokard konnte früh nach MI eine intrakardiale Induktion von Cyclin D1 und Cdc2 (Cell-division-cycle-2-Kinase) beobachtet  werden. Für beide Faktoren ist  bekannt, dass sie den Zellzyklus vorantreiben und bei der endothelialen Proliferation und in der Genese reifer Gefäßstrukturen eine wichtige Rolle spielen. In einem Modell der Rückenmarksischämie zeigte sich ebenfalls ein neuroprotektiver Effekt mit Verbesserung der neurologischen Funktion und Reduktion des Motoneuronenverlusts. Diese Effekte waren auf die Immigration von CD34+ Stammzellen, verstärkte Expression von „brain-derived neurotrophic factor“ und vaskulär endothelialem Wachstumsfaktor zurückzuführen. EPO ist somit in den von uns untersuchten Regenerationsprozessen am Herzen von besonderem Interesse. Aus diesem Grund sehen wir gerade in EPO einen wichtigen Ansatz zur Wirksamkeitsverbesserung regenerativer Therapien.
 
 

SDF-1 und Angiogenese

Technologische Ansätze zur Verstärkung der Einwanderung von Stammzellen in das Myokard wurden auf der Basis von Gentherapie und Matrixmolekülen entwickelt. Dabei waren nicht-virale Gentherapieansätze mit SDF-1 vielversprechend und zeigten eine vermehrte Einwanderung von CD117+ Knochenmarkstammzellen ins Myokard wie auch eine vermehrte Angiogenese. Ähnliche Resultate konnten allerdings auch mit Matrigel-Applikation erreicht werden. Ausgehend von diesen Untersuchungen wird derzeit an der Mechanismus-spezifischen Applikation von verschiedenen regenerativen Wirkstoffen gearbeitet.
 
 

AT2-Rezeptor Stimulation

Die kardiale Stammzell-vermittelte Therapie birgt ein großes Potenzial zur Behandlung von  Herzkrankheiten. Wir arbeiten daran, Wege zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit von intramyokardial applizierten Knochenmarkstammzellen für die myokardiale Regeneration zu finden. Wir führten hierzu Untersuchungen an Angiotensin II, dem Haupteffektor im Renin-Angiotensin-System durch, das den kardialen Reparaturprozess durch seine Rezeptormoleküle (ATR1 und ATR2) beeinflusst.
Aus der Erkenntnis, dass sich eine Post-Infarkt-Expression des AT2-Rezeptors in kardialen c-kit+ Progenitorzellen auffinden ließ, wollen wir jetzt den Regenerationsprozess des geschädigten Herzens mittels AT2-R-Modulation verbessern. In Nagern konnte hierbei eine Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit von Knochenmark-Progenitorzellen nach Präkonditionierung mit AT2-R Stimulation gezeigt werden.
Aufbauend auf diesen vielversprechenden Daten wollen wir jetzt translational orientierte und klinisch relevante Ansätze der AT2R-vermittelten kardialen Regeneration weiterentwickeln.
 

 

Impressum Das RTC wird gefördert durch das BMBF und dem Land MV mit Mitteln aus den Strukturfonds der EU.